檢驗(yàn)中
(一)致病菌分離鑒定
1.標(biāo)本(細(xì)菌)的接種、分離和鑒定
根據(jù)標(biāo)本和檢驗(yàn)?zāi)康牡牟煌臃N不同的培養(yǎng)基。對(duì)陽(yáng)性培養(yǎng)要分離純化,然后進(jìn)行分群和種屬鑒定。整個(gè)操作過(guò)程要按標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)進(jìn)行,不得隨意更改操作程序,對(duì)于疑難菌株,要查閱文獻(xiàn)、組織會(huì)診,不能草率作出結(jié)論。 2.檢驗(yàn)過(guò)程的記錄和結(jié)果報(bào)告
檢驗(yàn)過(guò)程中所見(jiàn)現(xiàn)象和發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題,均應(yīng)如實(shí)地記錄,以便于分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,作出正確結(jié)論和發(fā)出可信的報(bào)告,亦可作為今后總結(jié)和改進(jìn)工作的依據(jù)。所發(fā)報(bào)告內(nèi)容要登記,以便查詢;如原(初步)報(bào)告有誤或不完善,應(yīng)發(fā)糾正報(bào)告。
(二)藥敏試驗(yàn)質(zhì)控
藥敏試驗(yàn)應(yīng)嚴(yán)格按最新發(fā)布的NCCLS所規(guī)定的培養(yǎng)基、操作方法、藥敏紙片和判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。為了監(jiān)控試驗(yàn)過(guò)程的質(zhì)量,必須做好藥敏質(zhì)控。
1.常用的藥敏質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株
NCCLS從美國(guó)菌種收集中心(ATCC)選擇推薦了一些菌株作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)株(見(jiàn)表1)。
細(xì)菌[生物]
2.質(zhì)控株的保存盡管質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)株比其他一些菌株藥敏結(jié)果是相對(duì)穩(wěn)定的,但反復(fù)多次的傳代不可避免地會(huì)造成菌株的變異。為防止變異,必須將標(biāo)準(zhǔn)株凍干保存。每月從凍干株中復(fù)蘇1次,種入大豆胰酶消化肉湯中(厭氧菌可用GAM肉湯等)作為工作株。工作株可存于4℃~8℃,并于每周轉(zhuǎn)種1次。通常工作株轉(zhuǎn)種4~5次后即須棄去。在質(zhì)控中,如發(fā)現(xiàn)工作株結(jié)果有疑問(wèn),應(yīng)予以更換。反復(fù)傳代亦易使其敏感性變異,特別是銅綠假單胞菌(ATCC 27853),將會(huì)丟失對(duì)脲基青霉素的敏感性。如無(wú)凍干條件時(shí),可將質(zhì)控株置入:①含10~15%甘油的大豆胰酶消化肉湯,或②脫纖維羊(或兔)血,或③脫脂奶,或④含50%小牛血清的肉湯,存于-20℃以下環(huán)境中(最好-60℃以下),亦可防止變異。
3.藥敏質(zhì)控方法
質(zhì)控株應(yīng)每天隨臨床分離株一道進(jìn)行藥敏試驗(yàn),質(zhì)控株的藥敏結(jié)果如果在質(zhì)控允許范圍內(nèi)(參見(jiàn)最新CLSI文件),說(shuō)明實(shí)驗(yàn)條件符合要求,結(jié)果可信;若藥敏結(jié)果在質(zhì)控允許范圍外,則實(shí)驗(yàn)中可能存在差錯(cuò)。由于質(zhì)控允許范圍的最大值與最小值是質(zhì)控株在標(biāo)準(zhǔn)條件下多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的95%可信限,故20次連續(xù)質(zhì)控結(jié)果中僅允許1次落在范圍外,但不能偏離質(zhì)控允許范圍中間值[(最大值+最小值)/2]4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。由于允許范圍恰好包括4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差,故落在允許范圍外的抑菌圈直徑一定要在離中間值一個(gè)允許范圍(中間值±1個(gè)允許范圍)之內(nèi)。此外,20次或更多次藥敏結(jié)果的平均值應(yīng)接近中間值。如果20次連續(xù)質(zhì)控結(jié)果中≥2次或30次中有≥4次結(jié)果超出了允許范圍,則提示實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在問(wèn)題,必須查找原因加以解決。常規(guī)的藥敏質(zhì)控可按下法進(jìn)行:連續(xù)測(cè)定某藥對(duì)質(zhì)控株的藥敏結(jié)果,每天一次,共測(cè)20或30天,取得20或30個(gè)值。⑴如果20個(gè)值中僅有一個(gè)值,或30個(gè)值中僅有三個(gè)以下的值超出允許范圍,則結(jié)果基本可信,可改每天質(zhì)控一次為每周一次。此后,若某周出現(xiàn)一次質(zhì)控值超出允許范圍,則于當(dāng)天查找原因(包括用錯(cuò)紙片和質(zhì)控株,菌株污染,孵育條件錯(cuò)誤等),經(jīng)糾正明顯錯(cuò)誤后重測(cè),如結(jié)果在允許范圍內(nèi)可繼續(xù)每周一次的質(zhì)控;如未能找出明顯原因則需采取立即糾正措施:連續(xù)質(zhì)控五天,每天一次:①若五次結(jié)果皆在允許范圍以內(nèi),則繼續(xù)每周一次的質(zhì)控;②五次結(jié)果只要有一次失控,則存在系統(tǒng)誤差,需進(jìn)行增加的糾正措施:查找到原因,然后改每周一次質(zhì)控為每天一次,完成20(或30)天質(zhì)控,其間失控次數(shù)若在一次(或三次)以內(nèi),則再改為每周一次。⑵如果有兩個(gè)(或四個(gè))以上的值超過(guò)允許范圍,則繼續(xù)做每天一次的質(zhì)控。⑶每當(dāng)改變?cè)噭⑺幟艏埰团囵B(yǎng)基等時(shí),均要重新進(jìn)行連續(xù)20(或30)天的質(zhì)控。⑷每次失控均要查找原因,糾正后才能發(fā)出報(bào)告。 (三)培養(yǎng)基、試劑和染色的質(zhì)控
1.培養(yǎng)基的質(zhì)控
細(xì)菌[生物]
培養(yǎng)基的好壞直接關(guān)系到能否從標(biāo)本中分離到病原菌,是否出現(xiàn)典型的生化反應(yīng)現(xiàn)象等關(guān)鍵所在。我國(guó)大部分實(shí)驗(yàn)室都是自行制備,注意在培養(yǎng)基制備過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格控制。制備后及使用前嚴(yán)格檢查,妥善保存。標(biāo)明制備日期、失效期、組成、名稱批號(hào)等。培養(yǎng)基的質(zhì)控主要包括以下四個(gè)方面:①無(wú)菌試驗(yàn),每批培養(yǎng)基在高壓或過(guò)濾除菌后均要抽取樣本進(jìn)行培養(yǎng),以證實(shí)無(wú)菌生長(zhǎng)。②支持生長(zhǎng)試驗(yàn),以適宜的菌株接種,經(jīng)培養(yǎng)應(yīng)生長(zhǎng)良好。③選擇和抑制生長(zhǎng)試驗(yàn),對(duì)選擇性培養(yǎng)基應(yīng)至少分別選1株可生長(zhǎng)、1株被抑制菌進(jìn)行接種培養(yǎng),可生長(zhǎng)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好,被抑制菌應(yīng)不能生長(zhǎng)。④生化反應(yīng)培養(yǎng)基至少應(yīng)分別選陽(yáng)性和陰性反應(yīng)菌株各1株,以證實(shí)應(yīng)有的反應(yīng)。常用的質(zhì)控菌見(jiàn)表2,請(qǐng)正確選用。 2.生化反應(yīng)試紙和試劑的質(zhì)控
細(xì)菌[生物]
試紙和試劑無(wú)論是外購(gòu)的還是自制的,在使用時(shí)一定要注明開啟時(shí)間和失效期。測(cè)定代謝產(chǎn)物的試紙或試劑,要用已知陽(yáng)性和陰性的菌株進(jìn)行測(cè)試,并作好測(cè)試記錄。測(cè)定代謝產(chǎn)物的試劑,要防止細(xì)菌的污染。觸酶、氧化酶、凝固酶試劑在開瓶時(shí)以及使用中,每天至少要分別用一陽(yáng)性和陰性菌測(cè)試1次。桿菌肽、Optochin、ONPG、XV紙片(條)在開瓶時(shí)以及使用中,每周至少要分別用一陽(yáng)性和陰性菌測(cè)試1次(XV紙片僅做陽(yáng)性菌)。用于分枝桿菌鑒定的試劑在開瓶或配制時(shí),以及每次使用時(shí),均要做陽(yáng)性菌對(duì)照(鐵的攝取試驗(yàn)還要做陰性對(duì)照)。抗血清在開瓶時(shí)和使用中每月需分別用陽(yáng)性反應(yīng)和陰性反應(yīng)菌做1次測(cè)試。抗原檢測(cè)試劑和DNA探針在每次操作時(shí),均要設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照。其他試劑和紙片僅在開瓶或配制時(shí),做1次陰、陽(yáng)性反應(yīng)測(cè)試即可。各種常用試紙和試劑的質(zhì)控菌和預(yù)期結(jié)果見(jiàn)表3。細(xì)菌[生物]
3.染色的質(zhì)控 常用染色的質(zhì)控要求見(jiàn)表4 ,質(zhì)控結(jié)果應(yīng)作好記錄。(四)儀器設(shè)備質(zhì)量監(jiān)測(cè)
實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的各種儀器設(shè)備的運(yùn)行情況,應(yīng)每天進(jìn)行監(jiān)測(cè),每一儀器均要有專人按使用說(shuō)明書要求進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng),儀器上要附有運(yùn)行記錄卡,每天由維護(hù)保養(yǎng)人記錄溫度等指標(biāo)的變化情況。一旦發(fā)現(xiàn)異?;蚴Э兀瑧?yīng)立即查找原因并進(jìn)行維修。
(五)積極參加室間質(zhì)評(píng)
要按規(guī)定參加細(xì)菌學(xué)的室間質(zhì)評(píng),對(duì)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控水平進(jìn)行全面評(píng)估,不斷提高檢測(cè)水平。